24 ноября 1936 года заложена на заводе имени Марти (№194) в Ленинграде. По железной дороге секциями была доставлена на завод №202 во Владивостоке, где проводилась ее окончательная сборка. Старейшая из тихоокеанских лодок типа "С". 31 декабря 1940 года субмарина вступила в строй и 5 января 1941 года вошла в состав Тихоокеанского флота под командованием капитан-лейтенанта (позже капитан 3-го ранга) Братишко Дмитрия Кондратьевича.
На момент начала Великой Отечественной войны С-54 входила в состав 3-го дивизиона 1-й бригады подводных лодок Тихоокеанского флота во Владивостоке. В октябре 1942 года вместе с остальными лодками этого проекта была отправлена на север. Во время перехода из Гуантанамо в Галифакс произошел взрыв паров масла в одном из дизелей, и он вышел из строя на трое суток. На море разыгрался шторм, и лодка потеряла часть съемных листов легкого корпуса. Дело усугублялось тем, что батарея судна наработала уже 113 циклов из 130 и заряжалась всего на треть первоначальной мощности. По причине этого лодка не могла долго идти под водой. В Полярном не было сменной батареи, и командование приняло решение отправить субмарину для ремонта в Англию, куда она прибыла 10 января. Там была произведена замена батареи, текущий ремонт и установка новых приборов - гидролокатора и радара. В Полярном она оказалась только 7 июня 1943 года, зато в состоянии намного более лучшем, чем ее систершипы.
27 июня субмарина вышла в море с обеспечивающим комдивом А.В. Трипольским на борту. На следующий день она произвела свою единственную торпедную атаку группы охотников, шедших на соединение с конвоем. Залп завершился взрывом трех торпед при ударе о скалы. Немцы ни залпа, ни следов торпед не видели, поэтому прерывать своих задач не стали. Однако атака показала, что личный состав подготовлен недостаточно - боцман не мог удержать лодку на глубине, а при заполнении цистерн быстрого погружения на глубине 50-ти метров она упала на грунт. Несколько раз Братишко отказывался от нападения на боевые корабли противника (из-за неумелых действий боцмана лодка показывала на поверхности то корму, то рубку). После возвращения в базу боцман был немедленно списан с корабля, а так же заменили механика. Насколько это было эффективно трудно сказать, так как последующие два боевых похода были вдали от коммуникаций противника. 29 августа субмарина вернулась в базу, где находилась на текущем ремонте до конца года.
В очередной поход с 6 по 18 февраля 1944 года Братишко вышел в обеспечении комдива Трипольского. Утром 12-го противник был обнаружен, но атаке помешало большое расстояние и штормовая погода.
В последний (пятый) поход лодка вышла 5 марта 1944 года. После этого С-54 на связь не вышла и в базу не вернулась. Предположительно субмарина погибла на вражеском минном заграждении NW-31, поставленном минзагом "Остмарк" в районе Конгс-фьорда в июле 1943 года. В момент гибели на борту находилось 50 человек.